实时定量PCR分析的部分实施需要进行优化，确保所有反应参数设置准确，从而获得准确的结果 。荧光定量PCR常见的难点包括引物、探针、反应抑制和软件分析 。今天，小姐姐分享她在引物和探针方面的经验 。
【引物探针问题 怎样消除引物二聚体】
实时定量PCR几乎是现代分子生物学中最重要、应用最广泛的核酸定量检测技术 。成功的定量PCR实验离不开准确的实验设计和操作流程 。
引物二聚体引物二聚体的形成是最常见的问题之一 。当引物对之间的一些序列具有同源性时，可以形成引物二聚体 。如果引物在Chuangye.com的PCR反应过程中退火形成二聚体，Taq DNA聚合酶可以延伸二聚体形成比原始引物更长的产物，这在循环过程中更容易导致退火错误 。
问:引物二聚会引起哪些问题？
引物二聚体对反应的影响很大程度上取决于反应中使用的化学物质 。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大，这是因为探针退火和断裂的现象很少发生在引物二聚体区域 。此时，引物的竞争是需要考虑的主要问题 。基于双链DNA结合染料的反应受引物二聚体的影响很大 。因为染料的结合模式是非特异性的，所以在反应过程中监测的荧光信号可以被增强 。这可以相应地改变Ct值，使结果偏离 。
问:如何确定是否存在引物二聚体？
凝胶电泳是显示引物二聚体的一种很好的方法 。引物二聚体在凝胶底部形成扩散带，通常低于100 bp 。单纯凝胶电泳的缺点是灵敏度最低只有纳克级，所以可能得不到结果 。
熔解曲线也是显示引物二聚体的一种方法 。如果扩增具有优异的特异性，实时荧光定量PCR平板上每个反应孔的解离曲线将具有狭窄的单峰 。引物二聚体的荧光强度低，显示出宽的“波形”，表明它在约70℃熔化(见图1) 。
文章插图
问:如何设计和优化实验以避免引物二聚体？
最好在引物设计阶段采取简单的预防措施，避免从一开始就形成二聚体 。如果出现引物二聚体，有很多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体 。
1.第一步是优化热循环条件，主要是提高退火温度 。大多数情况下，两步循环(从95°C变性步骤直接到60°C退火和延伸步骤)有利于强扩增，因此引物设计中成功设定的退火温度为60°C 。
2.它可以降低引物浓度，甚至有助于使用不同比例的正向引物和反向引物 。大多数情况下，每个引物的理想最终浓度为200~600 nM，但必要时可降至60 nM 。
3.镁的最佳浓度一般为3 mM左右，超过这个浓度，引物二聚体容易形成 。
4.如果尚未评估引物形成二聚体的趋势，则应进行补充和重新设计(如有必要) 。一般最好用热启动DNA聚合酶，在冰上进行反应 。
5.理论上，对于同一目标，应该同时检测多个引物组 。事实上，这可以节省很多时间，因为如果这些引物中的一个可以立即工作，则可以减少优化过程中花费的时间 。
引物和探针的储存引物和探针储存不当会导致降解和特异性丧失，进而影响反应效率 。影响引物和探针稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否长时间暴露、储存引物和探针的浓度以及储存液的成分 。
问:如何长期保持引物和探针的稳定性？
保持引物和探针的稳定性有四个关键点 。冻干引物在储存时间和温度上具有更好的灵活性 。一旦引物重新溶解，应在-20℃下储存，如果储存超过一年，应监测其功能是否下降 。对于标记的引物和探针，应采取措施避免标记物暴露(例如，使用不透明的试管并将其置于黑暗中)，以延长其使用寿命 。
引物浓度也会影响其稳定性 。建议引物贮存浓度不低于10m；；事实上，在大多数情况下，100 M引物浓度更容易操作 。引物和探针也应分开储存，以减少冷冻和解冻时间，特别是标记的引物和探针 。最后，TE缓冲液可以形成比水更稳定的环境 。此外，含有0.1 mM EDTA(标准TE中1 mM EDTA)的TE缓冲液是理想的溶液，因为某些PCR反应可能对EDTA有一定的残留敏感性 。
NTC放大当引物二聚体形成时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可以观察到荧光信号 。在另一种情况下，在存在污染物的情况下，无论是基于探针或双链DNA结合染料的反应，在NTC孔中也将观察到引物二聚体的扩增 。这可能是一个随机事件，并不是所有的NTC都会被放大，这通常是由不寻常的采样错误引起的 。如果在每个NTC反应中发生扩增，很可能有一种或两种试剂被污染 。
推荐阅读
- 缺少父亲陪伴的孩子，长大了就一定是问题少年吗？
- 代号SOG登录错误怎么办-登录问题解决方案汇总欢迎阅读
- 孩子的行为问题常常来源于家人的分歧
- 我的侠客充值返利什么时候返-开服常见问题解答成为攻无不克的玩家
- 真心话比较狠的问题有哪些
- 怎么去毛孔(如何去除毛孔粗大问题)
- 安全证书有问题怎么办？如何解决网站安全证书有问题的方法
- 我的侠客开局问答答案-开局问题答案是什么2020新发布
- 婆婆管得太多，婆媳问题自然就来了，还会影响到孩子
- 你了解自己的孩子吗？回答上这九问题再说